線性范圍的評估及數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗樣本的基本要求和制備方法

基本要求

樣本基質(zhì)應(yīng)與臨床實(shí)驗樣本相似，但不可采用含有對測定方法具有明確干擾作用物質(zhì)的樣本，如溶血、脂血、黃疸或含有某些特定藥物的樣本。進(jìn)行血清學(xué)標(biāo)志物檢測時，理想的樣本為分析物濃度接近預(yù)期測定上限的混合人血清。

建立一種定量測定方法的線性范圍時，需在預(yù)期測定范圍內(nèi)選擇7-11個濃度水平。如將預(yù)期測定范圍加寬至130%，在此范圍內(nèi)選擇更多的濃度水平，然后依據(jù)實(shí)驗結(jié)果逐漸減少數(shù)據(jù)點(diǎn)直至表現(xiàn)出線性關(guān)系，可發(fā)現(xiàn)最寬的線性范圍。

當(dāng)對標(biāo)稱線性參數(shù)進(jìn)行驗證時，需在已知線性范圍內(nèi)選擇5-7個濃度水平。

無論是建立或驗證線性范圍，所選用的濃度水平應(yīng)可覆蓋整個預(yù)期測定范圍并包括與臨床有關(guān)的重要評價濃度，如最小測定濃度或線性范圍的最低限、不同的醫(yī)學(xué)決定水平、最大測定濃度或線性范圍的高限等。

制備方法

不同濃度水平的樣本可通過將高濃度樣本與低濃度樣本進(jìn)行倍比稀釋得到，注意在進(jìn)行液體吸取時應(yīng)選擇精密度與準(zhǔn)確性好的移液裝置。制備時應(yīng)將樣本完全混合并避免蒸發(fā)或其他使樣本變質(zhì)的情況。每份樣本的濃度與體積單位應(yīng)統(tǒng)一。

如果高/低濃度血清的值未知，可將每種血清編碼，用編碼代表每個血清的相對濃度。對于等濃度間隔樣本，可用連續(xù)整數(shù)（如1、2、3、4、5）代表連續(xù)樣本。進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時可用樣本號代替X值。表1和表2中描述的樣本制備過程是按照等濃度間隔的設(shè)計進(jìn)行的，每個濃度水平的樣本量為1.00ml。

表1：11個濃度水平的樣本制備

樣本號	1	2	3	4	5	6
低濃度血清(ml)	1.00	0.90	0.80	0.70	0.60	0.50
高濃度血清(ml)	0.00	0.10	0.20	0.30	0.40	0.50
樣本號	7	8	9	10	11
低濃度血清(ml)	0.40	0.30	0.20	0.10	0.00
高濃度血清(ml)	0.60	0.70	0.80	0.90	1.00

表2：5個濃度水平的樣本制備

樣本號	1	2	3	4	5
低濃度血清(ml)	1.00	0.75	0.50	0.25	0.00
高濃度血清(ml)	0.00	0.25	0.50	0.75	1.00

制備非等濃度間隔的樣本時應(yīng)明確各樣本間的濃度關(guān)系，測定時可以這些樣本間的相對濃度比值做為X值。

樣本的特殊處理：在無法得到適用的人血清時，需對樣本進(jìn)行一些特殊處理以滿足實(shí)驗要求。這些處理過程包括稀釋、加入添加物或透析、熱處理等，無論進(jìn)行何種處理均應(yīng)以保持基質(zhì)恒定為基本原則。在評價報告中應(yīng)對所使用的稀釋液、添加物、溶劑等的材料來源加以注明。

樣本稀釋液應(yīng)選用由廠家推薦或經(jīng)實(shí)驗室證明可使用的產(chǎn)品，如可采用5%牛血清白蛋白或人白蛋白溶液。欲提高樣本濃度時可在樣本中添加分析物純品。在添加物為溶液狀態(tài)時，應(yīng)注意添加液體對樣本的稀釋作用（小于10%）并注明所用溶劑。

實(shí)驗過程

建立線性范圍：需測定9-11個濃度水平，每個濃度水平重復(fù)測定3-4次。
驗證標(biāo)稱線性參數(shù)：需測定4-6個濃度水平，每個濃度水平重復(fù)測定3-4次。
所有樣本應(yīng)在一次運(yùn)行中或幾次間隔很短的運(yùn)行中隨機(jī)測定，最好在一天之內(nèi)完成。

數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)記錄

可參考下表進(jìn)行數(shù)據(jù)記錄,也可采用其它形式進(jìn)行記錄，但應(yīng)注意保留原始數(shù)據(jù)。

項目：				樣品：
儀器：		試劑/批號：		校準(zhǔn)品/批號：
操作者：		審核者：		測定日期：
樣本號	測定1	測定2	測定3	測定4	均值
1
2

數(shù)據(jù)可用性檢查

可通過繪制散點(diǎn)圖對測定數(shù)據(jù)的可用性進(jìn)行初步檢查。以樣本號或樣本濃度為X軸，以測定結(jié)果為Y軸做圖，在圖上標(biāo)出針對每個樣本的測定值及每個濃度水平的測定均值，手工或用計算機(jī)做圖將均值點(diǎn)相連，觀察數(shù)據(jù)點(diǎn)與直線間的偏差，如偏差過大，表明數(shù)據(jù)組存在明顯非線性，需要對測定過程進(jìn)行檢查，排除因操作錯誤所至誤差，并對樣本進(jìn)行重新測定。如圖形與直線接近，表明可對數(shù)據(jù)組繼續(xù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

剔除離群值

離群值可由散點(diǎn)圖初步判斷，標(biāo)準(zhǔn)中建議采用格拉布斯（GRUBBS）法進(jìn)行離群值檢驗。檢驗步驟如下：

1. 每組數(shù)據(jù)中有4個測定結(jié)果，分別記為 y1，y2，y3，y4。
2. 將4個測定值按大小順序排列，最大值記為max，最小值記為 min;
3. 由4個測定值計算均值y和標(biāo)準(zhǔn)差S：
y=(y1+y2+y3+y4)/4；
4. 根據(jù)可疑值 max或 min分別按下式計算統(tǒng)計量t：
t1 = (max-)/S，t2 = (min-)/S;
5. 根據(jù)給定的顯著性水平a和重復(fù)測定次數(shù)查表得臨界值，如t值大于臨界值，則相應(yīng)的可疑值為離群值。

進(jìn)行多項回歸分析

對數(shù)據(jù)組進(jìn)行多項回歸分析，得到一級、二級與三級多項式。一級多項式為直線，二級多項式表示上升曲線或下降曲線，三級多項式表示S形曲線（在測量范圍兩端具有明顯的非線性）。多項式方程如下：

級數(shù)	多項式	回歸自由度（Rdf）
一級	Y = b0 + b1X	2
二級	Y = b0 + b1X + b2X²	3
三級	Y = b0 + b1X + b2X² + b3X³	4

對回歸方程進(jìn)行線性檢驗

多元回歸方程中以bi表示的系數(shù)為回歸系數(shù)。在二級與三級方程中，b2與b3為非線性系數(shù)。對回歸方程進(jìn)行線性檢驗就是對每個非線性系數(shù)作t檢驗，判斷回歸系數(shù)與零是否有顯著性差異。b0與b1不反映非線性，故不需對其進(jìn)行檢驗。對b2與b3的檢驗方法如下：

計算統(tǒng)計量t，計算公式為：
t = b_i/ SE_i
式中SE_i 為每個非線性系數(shù)的斜率標(biāo)準(zhǔn)誤，計算公式為：
斜率標(biāo)準(zhǔn)誤計算公式；；
；
其中，Y為回歸方程預(yù)測值，平均值X 與平均值Y 與為測定均值。

由公式df = L*R-Rdf 計算自由度，L為樣本數(shù)，R為每個樣本的測定次數(shù)，Rdf為回歸自由度，即回歸方程中系數(shù)（包括b0）的個數(shù)。如測定5樣本，每個樣本重復(fù)測定4次，則對測定數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析后其三級多項式中L=5，R=4，Rdf=4，df=5*4-4=16。在t值表中尋找t界值（雙邊檢驗，α=0.05），將計算出的t值與界值比較，如p>0.05，表示非線性系數(shù)與零無顯著性差異，數(shù)據(jù)組被認(rèn)為具線性，此時可對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗，具體方法見后。當(dāng)精密度符合線性判斷要求時，數(shù)據(jù)分析可結(jié)束。如p<0.05，表示此非線性系數(shù)具有統(tǒng)計學(xué)顯著性，數(shù)據(jù)組為非線性，此時應(yīng)進(jìn)行臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗。

臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性與非線性檢驗

上述多項式回歸分析主要是利用統(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行線性判斷，統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的線性可稱為一階線性，對數(shù)據(jù)組的要求很高。對于在臨床實(shí)驗室中使用的測定方法，在其臨床應(yīng)用實(shí)踐中允許有一定的非線性誤差，此時通過對統(tǒng)計學(xué)標(biāo)準(zhǔn)的非線性作程度判斷，可得到臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性，即二階線性。

臨床標(biāo)準(zhǔn)的線性檢驗中使用了兩個統(tǒng)計量，ADL（偏離直線平均差異，average deviation from linearity）與PctBnd（百分區(qū)界，percent bound），對于大多數(shù)分析物PctBnd取5%。如ADL小于所要求的臨界判斷值，則可認(rèn)為數(shù)據(jù)組具有臨床可接受的線性，所擬合出的最適非線性多項式無臨床意義。

ADL值的計算：

ADL表示最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異，其計算公式如下：

最優(yōu)擬合曲線與直線的平均差異
式中p(x)表示最優(yōu)擬合二階或三階方程的擬合值，a+bx表示擬合一階方程的擬合值，L表示樣本數(shù)，c表示總平均濃度（全部測量數(shù)據(jù)的平均值）。

將ADL與臨界值比較

一般設(shè)定ADL小于5%為臨床允許誤差，即取PctBnd為5%，通過查表（見附表A與B）得到ADL臨界值。如ADL小于臨界值，可認(rèn)為多項式具有臨床可接受的非線性，為二階線性。如ADL大于臨界值，則為臨床不可接受的非線性。

對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗

測量數(shù)據(jù)的精密度可直接影響多項式回歸分析的結(jié)果，為提高統(tǒng)計功效，需對數(shù)據(jù)組進(jìn)行精密度檢驗。

計算最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（σ）

回歸標(biāo)準(zhǔn)誤差
式中yi表示各個測量值，p(xi)表示最優(yōu)擬合方程的擬合值，n表示樣本數(shù)乘以重復(fù)次數(shù)(L x R)，d表示最優(yōu)擬合方程的階數(shù)。

計算不精密度

用最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤（σ）與總平均濃度( 總平均數(shù) )的百分比代表不精密度。

數(shù)據(jù)組的不精密度檢驗

跟據(jù)以下公式進(jìn)行判斷：

不精密度檢驗
式中σ表示最優(yōu)擬合方程的回歸標(biāo)準(zhǔn)誤，總平均數(shù) 表示總平均濃度，L表示樣本數(shù)，R表示重復(fù)測量的次數(shù)，C表示常數(shù)(附表C)，PctBnd：取5%。

不精密度滿足判斷式時，說明數(shù)據(jù)的精密度好可作線性評價。反之則表示數(shù)據(jù)的精密度差，不能作線性評價。當(dāng)PctBnd取5%時，尚可通過查不精密度和臨界值表判斷數(shù)據(jù)是否精密 (附表A和B)，如此時不精密度對應(yīng)的臨界值顯示P，表明測量數(shù)據(jù)的精密度不符合作線性判斷的要求。

結(jié)果報告

線性范圍報告的具體格式不要求，但至少應(yīng)包括以下幾方面：

進(jìn)行線性評價的實(shí)驗室或生產(chǎn)廠家名稱。

被評價的方法或試劑名稱，批號。

測定項目。

線性范圍（如為二階線性應(yīng)包括臨床允許誤差）。

如可能應(yīng)標(biāo)出測定項目的醫(yī)學(xué)決定水平及在此水平處的臨床允許誤差。

附錄：

表A：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=1或2階）

σ/%	L*R=10	L*R=12	L*R=14	L*R=16	L*R=18	L*R=20
1	5.5	5.5	5.4	5.4	5.4	5.4
2	6.1	6.0	5.9	5.8	5.8	5.7
3	6.6	6.4	6.3	6.3	6.2	6.1
4	7.1	6.9	6.8	6.7	6.6	6.5
5	6.6	7.4	7.2	7.1	7．0	6.9
6	8.2	7.9	7.7	7.5	7.4	7.2
7	8.7(P)	8.4(P)	8.1	7.9	7.8	7.6
8	P	P	8.6(P)	8.3(P)	8.1	8.0
9	P	P	P	P	8.5(P)	8.3(P)
>9	P	P	P	P	P	P

L*R：樣本數(shù)*重復(fù)測量的次數(shù)

表B：不精密度和ADL的臨界值（PctBnd=5%，d=3階）

σ/%	L*R=10	L*R=12	L*R=14	L*R=16	L*R=18	L*R=20
1	5.5	5.5	5.4	5.4	5.4	5.4
2	6.1	6.0	5.9	5.9	5.8	5.8
3	6.7	6.5	6.4	6.3	6.2	6.2
4	7.2	7.0	6.9	6.8	6.7	6.6
5	7.8	7.6	7.4	7.2	7.1	7.0
6	8.4	8.1	7.9	7.7	7.5	7.4
7	9.0(P)	8.7(P)	8.4	8.2	8.0	7.8
8	P	P	8.9(P)	8.6(P)	8.4	8.2
9	P	P	P	P	8.9(P)	8.7(P)
>9	P	P	P	P	P	P